原代神經(jīng)干細(xì)胞

1. 犧牲胎齡14-16天的SD大鼠，刮除腹部手術(shù)區(qū)域的毛發(fā)，75%乙醇全身浸泡消毒。

2. 解剖孕鼠，取出子宮并沖洗。

3. 取出胚胎，置于含有冰冷的HBSS液平皿中。

4. 手shu顯wei鏡下剝離出大腦半球，小心地剝?nèi)ツX膜和血管。

5. 剝?nèi)ツX膜和血管的大腦皮質(zhì)，用冰冷的HBSS液清洗三次。

6. 將大腦皮質(zhì)剪成1mm³的小塊，用1ml槍頭輕輕吹打后，使之成為細(xì)胞懸液，并通過(guò)70um的篩網(wǎng)過(guò)濾。

7. 將收集到的細(xì)胞懸液離心后，用神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，然后離心，棄掉上清液。

8. 經(jīng)計(jì)數(shù)和活力觀察，將細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁶/ml，以1.5×10⁵/ml的細(xì)胞密度種入T25培養(yǎng)瓶中，同時(shí)加入FGF-2和EGF于5%CO₂、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，直到神經(jīng)干細(xì)胞分裂、增殖形成較大的神經(jīng)細(xì)胞球后再作傳代處理。

9. 細(xì)胞傳代，將神經(jīng)細(xì)胞球懸液移至離心管，經(jīng)低速離心后，吸棄上清液，加入神經(jīng)干細(xì)胞完quan培養(yǎng)液，用200ul槍頭吹打，使之成為單個(gè)細(xì)胞懸液，定量加入神經(jīng)干細(xì)胞完quan培養(yǎng)液后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力觀察。

10. 傳代后的細(xì)胞既可用來(lái)誘導(dǎo)分化，也可以繼續(xù)種瓶培養(yǎng)，還可以冷凍保存以備后用。

11. 神經(jīng)干細(xì)胞的分化和鑒定。